切向流过滤：血红蛋白纯化

在现代医学中，输血是出血性休克、贫血等病症重要的治疗方法，也是常规手术的重要组成部分，但是肝炎及AIDS等小概率传播风险，总是干扰着输血的安全进行。此外，输血前，还需对供体血液进行分型，并与受体血型交叉匹配，以避免出现排异现象。对此，一种相对简便的替代方法是，使用血红蛋白（Hb）类氧载体（HBOCs）取代供体红细胞（RBCs），其具有以下优点：首先，由于HBOCs表面没有血型抗原，一般不会引起排异现象；其次，在Hb纯化过程中灭活并清除了病毒，所以大大降低了血源性疾病传播的可能性。

Hb通常从人或牛RBCs（hRBCs或bRBCs）中提取。对纯化的Hb进行化学修饰是HBOCs合成的一种主要途径，化学修饰型HBOCs可以通过分子内交联Hb、聚合Hb或将聚合物结合到Hb表面的方法来完成。Hb也可以包埋到固体或中空颗粒内部，以形成非化学修饰型HBOCs。

从裂解的RBCs中提取并纯化Hb前，需先去除血液中的白细胞、血小板及血浆成分，可先离心并漂洗血液，以分离血浆和白细胞层。所得的RBCs再用低渗溶液孵育裂解。

从RBC裂解液中纯化Hb的方法有很多种，包括有机溶液萃取以及离子交换色谱分离。色谱方法又可以大体归类为吸附方法（Hb被截留在固相介质内，然后溶剂洗脱）或直流方法（杂质被截留，而Hb被洗脱）。直流方法消除了吸附和洗脱过程，但与吸附方法相比，所得的Hb纯度较低。但两者都受到血细胞裂解方法及裂解状态的影响。

在还原剂存在的绝氧条件下进行加热，也可以进行Hb的纯化。在该过程中热敏感性蛋白选择性沉淀，而病毒被灭活，但Hb也有可能因为高温而失活，所以需要添加稳定剂，以防止Hb变性。

微滤和超滤也是Hb纯化的常用技术，可有效降低Hb溶液中的病毒载量。但是常规的过滤技术通常需要配合化学修饰和分馏操作，以从未修饰型Hb和其它杂质中分离修饰型Hb，且由于细胞碎片堵塞膜孔，造成流速降低。针对这些问题，本文将介绍一种多阶段式过滤方法。在该方法中，大多数细胞碎片在第一阶段（膜MWCO 50nm）被清除，然后连续过滤，逐步清除较大的细胞碎片和分子。该技术相对简单，且可同时进行Hb的纯化和浓缩。

材料 & 方法

RBCs溶液起始处理量为1,000 mL，离心后，用等渗盐水漂洗去除非细胞性Hb和血浆蛋白，再用PB溶液冰浴裂解RBCs，裂解液终体积为2,000 mL。

仪器使用KrosFlo 研发用IIi 切向流过滤系统（SYR2-U20-01N）和4根中空纤维过滤组件，组件MWCO规格分别为50nm（M10S-360-01P）、500kD（M1-500S-260-01N）、100kD（M1AB-360-01P）和50kD（M15S-360-01P）。系统设置如图1。组件使用前用去离子水完全浸湿，并进行完整性测试。

在每个过滤阶段，收集滤液，并循环回流液，以提高Hb产量。但在阶段III，1L的PB溶液进行洗滤操作。整个纯化工艺在生物安全柜内进行，滤液及回流液容器置于冰上。每个阶段开始和结束时测量滤液流速和跨膜压，并在各阶段处理结束后，从滤液中取出10mL，做进一步分析。阶段I起始过滤量为2,000 mL RBCs裂解液。每次运行结束后，HF组件、相关软管和容器均用0.5M NaOH溶液清洗，以清除可能粘附到HF膜上的蛋白，并降解可能存在的内毒素。