PUC57 Simple TA/平端通用克隆载体（含感受态）

描述：pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min 就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产 品适用于 Taq 酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。 组分 组 分 D2401(20T) D2402 (20T) pUC57 Simple Vector(5 ng/μl) 20 μl 10 μl M13F(-47) (10 μM) 100 μl 100 μl M13R(-48) (10 μM) 100 μl 100 μl RTS DH5α 冻干感受态 2 瓶 无 Nano E.coli Transfection Reagent 1ml 无 注意：RTS DH5α 冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2 年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3 个月）。 主要特征 （1）快速连接，最快仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含 任何酶切位点，便于后续亚克隆（5）平末端和 A 尾产物通用。 注意：引物不能磷酸化。 测序引物 正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’； 反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；

操作步骤 1. PCR 产物的纯化 1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂 盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。 1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。 1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。 2. PCR 用量和连接时间 PCR 产物大小 PCR 产物用量 载体用量 摩尔比 连接时间 阳性率 0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95% 1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90% >3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85% 3. 连接反应 向 0.2 ml EP 管中依次加入如下试剂 成 分 用 量 PCR 产物 0.5~4 μl （用量参考上表） pUC57 Simple Vector 1 μl 加无菌水至总体积为 5 μl 轻轻吹打混合均匀后，室温（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。 关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物 的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连 接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效 率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。 4. 转化(以 RTS DH5α 克隆感受态细胞为例说明) 4.1 从-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent 彻底融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli Transfection Reagent 加入到一支冻干感受态细胞中，并分装到 10 支 1.5 ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。 4.2 将 5 μl 连接产物加入到分装的感受态细胞中，轻弹 EP 管（或枪头轻轻吹打），置于冰上 15 min。 注意：放置时间不要超过 30 min，过长时间会导致核酸聚合，从而影响转化效价。 4.3 置于 42°C 热激 1min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。 4.4 热激完毕后，向上述感受态细胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培养基，37°C 振荡（225 rpm）培养 60 min。 使质粒上抗性标记基因表达，菌体复苏。 4.5 取 200 μL 复苏菌液涂布到含相应抗生素的 LB 琼脂平板表面。 4.6 将平板置于 37°C 培养，12~18 小时后可出现菌落。 注意：如使用液体感受态，直接将 5 μl 连接后产物加入到液体感受态，并参照液体感受态操作方法即可。

pUC57 Simple通用克隆载体采用了TOPO酶连接技术，载体预先偶联上TOPO酶，当加入PCR扩增产物后，5 min就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产品适用于Taq酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的PCR产物的连接，载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。

优势

快速连接，最快仅需5min； 操作简单，仅需加入载体和片段即可； 无需蓝白斑筛选，阳性率高； 不包含任何酶切位点，便于后续亚克隆。 平末端和A尾产物通用。 注意：引物不能磷酸化。

组分

组分名称 D2401（20T） D2402 (20T) pUC57 Simple Vector(5 ng/μl) 20μl 20μl M13F(-47) (10 μM) 100μl 100μl M13R(-47) (10 μM) 100μl 100μl RTS DH5α冻干感受态 2瓶 无 Nano E.coli Transfection Reagent 1 ml 无

储存

RTS DH5α冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3个月）。

图谱

测序引物

正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’； 反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；

实例

1.应用pUC57 Simple TA平端通用克隆载体分别连接长度为2008bp的平端产物和A尾产物，挑20个菌进行菌检，阳性率分别为95%和85%。

2.不同的载体与片段的摩尔比对连接效率的影响 片段长2432bp，使用载体与片段摩尔比分别为1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；1：10 室温连接5min后转入RTS-DH5α冻干感受态，通用引物菌检阳性片段长度为菌检阳性片段大小为2572bp。结果表明载体与片段摩尔比1:1；1:2；1:3；1:4；1:6；1:9时均有较高的阳性率，而1:5；1:7；1:8；1：10则阳性率稍低，说明连接反应时应选择正确的载体与连接片段摩尔比，推荐最佳摩尔比为1:3。

3.不同连接时间对连接效率的影响 平端产物片段长2432bp，载体与片段摩尔比分别为1:3，分别室温连接5min、10min、15min、20min、25min、30min后转入RTS-DH5α冻干感受态，通用引物菌检阳性片段长度为菌检阳性片段大小为2572bp。结果表明不同的连接时间对于菌斑数和阳性率的影响较小，无明显差别，建议当连接片段<2500bp时，可选择室温连接5min。

4.不同长度的平端产物片段对连接效率的影响 平端产物片段长度分别为500bp、1kb、2kb和5kb，载体与片段摩尔比分别为1:3，前三个片段室温连接5min，5kb片段室温连接30min，转入RTS-DH5α冻干感受态，通用引物菌检。结果表明长片段连接后菌斑数较短片段减少，但阳性率无明显差别。

5.不同长度的A尾产物片段对连接效率的影响 A尾产物片段长度分别为500bp、1kb、2kb、2.5kb和5kb，载体与片段摩尔比分别为1:3，前四个片段室温连接5min，5kb片段室温连接30min，转入RTS-DH5α冻干感受态，通用引物菌检。结果表明片段长度在500bp~2.5kb之间时阳性率无明显差别，当片段长度≥5kb时阳性率有所降低，此时应适当增加菌检数量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！